《美国队长2》中，美国队长史蒂夫·罗杰斯（由克里斯·埃文斯 Chris Evans 饰）渐渐适应了现代生活，然而，在一次行动后，他开始意识到神盾局内部弥漫的危险气息。当他得知神盾局正在进行秘密的“洞察计划”时，愤怒之情更是油然而生。某天，神盾局指挥官尼克-法瑞（由塞缪尔·杰克逊 Samuel L. Jackson 饰）遭到武装分子的袭击，他竭尽全力将一支U盘交到美国队长手中，里面藏着该局二战以来最重要且最可怕的秘密。随后，美国队长被指控谋杀尼克，前局长亚历山大·皮尔斯（由罗伯特·雷德福/Robert Redford 饰）对其进行通缉和追捕。在逃亡的过程中，美国队长得到了黑寡妇（斯嘉丽·约翰逊 Scarlett Johansson 饰）和老兵“猎鹰”（安东尼·麦凯 Anthony Mackie 饰）的帮助。他们必须竭尽全力，解开神盾局的秘密，阻止“洞察计划”的实施，以避免灾难的发生。
